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A importância do conhecimento do genoma para a produção de aves

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A importância do conhecimento do genoma para a produção de aves
A importância do conhecimento do genoma para a produção de aves
Mônica Corrêa Ledur1, Kátia Nones2, Helena Javiel Alves2 e Giovani Rota Bertani1
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Embrapa Suínos e Aves, Caixa Postal 21, 89700-000, Concórdia – SC, Brasil
email: [email protected]
Departamento de Zootecnia – ESALQ/USP, Piracicaba – SP, Brasil
Introdução
Nas últimas décadas a avicultura tem se tornado altamente tecnificada e ocupa lugar de
destaque dentro da agropecuária brasileira e mundial, alcançando altos índices de
desempenho na produção de carne e ovos. As características de produção, tanto de aves de
corte como de postura, tiveram um crescimento enorme no século passado. A produção de
ovos aumentou cerca de 3 vezes nas últimas décadas e o tempo necessário para que frangos
de corte atinjam peso de abate (1,5 kg) diminuiu cerca de 4 vezes (Burt, 2002). O
melhoramento tradicional, baseado na teoria da genética quantitativa, tem assegurado
ganho genético contínuo na maioria das características de interesse econômico em aves. A
maior parte do progresso genético obtido tem sido decorrente da seleção baseada no
fenótipo do animal ou na estimativa do valor genético aditivo derivado do fenótipo. Essa
seleção é realizada sem o conhecimento do número e do efeito dos genes que atuam nas
características de interesse (Dekkers, 1999). Associadas às melhorias obtidas pelo
melhoramento tradicional, surgiram características correlacionadas indesejáveis, como o
aumento de doenças metabólicas, carne de baixa qualidade (PSE - pálida, flácida e
exsudativa), redução da fertilidade, queda na resposta vacinal e redução da resistência a
doenças infecciosas em aves de corte e aumento da incidência de osteoporose e problemas
na qualidade da casca do ovo em poedeiras (Burt, 2002). A genética molecular poderá ser
utilizada para melhorar estas características e outras de interesse econômico sem prejudicar
os ganhos já obtidos nas características de produção.
Com o desenvolvimento da biotecnologia, várias metodologias poderão ser utilizadas para elucidar o controle
genético de características complexas, como é o caso das características de produção e as relacionadas à
resistência a doenças. Essas metodologias possibilitam a identificação de regiões cromossômicas associadas a
QTLs (quantitative trait loci - loci que controlam características quantitativas) e mutações funcionais (que
causam alteração na expressão do gene). A genética molecular poderá ser utilizada como complemento em
programas de melhoramento, através da seleção assistida por marcadores (MAS), visando eliminar algumas
limitações da seleção baseada no fenótipo. A seleção diretamente pelo genótipo resultará em uma seleção
mais acurada ou precoce ou ainda de mais baixo custo (Dekkers e Hospital, 2002), dependendo da
característica em questão. O uso de ferramentas moleculares possibilitará a identificação de genes que
controlam características de importância econômica auxiliando e acelerando programas de melhoramento
animal, principalmente para características difíceis de serem medidas, de alto custo de avaliação, de baixa
herdabilidade ou limitadas pelo sexo. O objetivo deste trabalho é descrever os avanços obtidos nas pesquisas
em genômica de aves e suas implicações no melhoramento das características de produção.
Importância do estudo do genoma
O termo genoma é utilizado para designar toda a informação genética de um organismo. O estudo do genoma
visa o conhecimento amplo da estrutura e função dos genes. Paralelamente aos estudos do genoma humano,
busca-se o conhecimento do genoma de espécies modelo como drosophila, levedura, camundongo e rato que
servem para estudos comparativos entre espécies. O estudo do genoma de plantas e animais domésticos é
incentivado pela possibilidade de aplicação desse conhecimento para finalidades econômicas na agricultura,
no entanto, também pode ser de grande valia para as ciências biomédicas. A análise do genoma de aves,
suínos, bovinos e ovinos facilitará a dissecação da arquitetura genética das características poligênicas como
ganho de peso, eficiência alimentar, balanço energético, fertilidade e resistência a doenças. Essas informações
levarão ao melhor entendimento da base genética da variação fenotípica entre e dentro de espécies, que para a
produção animal, abrirá novos rumos para a melhoria e evolução das características de interesse econômico
(Bouchez e Hofte, 1998; Delneri et al., 2001; Fields et al., 1999; Georges e Andersson, 1996; Jacob, 1999;
Lander e Weinberg, 2000; McKusick, 1997; Woychik et al., 1998 e Andersson e Georges, 2004).
Mapeamento genômico
De acordo com Burt (2002), existem 4 áreas de interesse na genômica de aves: 1) Identificação e mapeamento
de marcadores genéticos; 2) Mapeamento de QTL; 3) Identificação de genes candidatos e 4) Descoberta de
genes.
A partir dos mapas de ligação de 3 populações (Compton, East Lansing e Wageningen),
Groenen et al. (2000) criaram um mapa consenso do genoma da galinha, apresentando um
total de 1889 loci distribuídos em 3800 cM, que foi posteriormente atualizado por Schmid
et al. (2000). Atualmente (22/04/2004) existem 2522 loci no mapa de ligação da galinha
incluindo 757 genes identificados (ARKdb:http://www.thearkdb.org/; Hu et al., 2001). Este
mapa, rico em informações sobre marcadores, é imprescindível para o mapeamento de QTL
em populações de aves. Os próximos passos serão a descoberta de novos marcadores para
adensar ainda mais este mapa e a busca por genes ou mutações nas regiões já associadas a
QTLs que possam explicar a variação fenotípica determinada por estes QTLs. Entendendo
como esses genes funcionam e como influenciam as características econômicas será
possível buscar novos direcionamentos para melhorar o desempenho e a qualidade do
produto final.
Uma primeira versão do seqüenciamento do genoma de galinha foi divulgada em 1º de
março de 2004 pela Washington University Genome Sequencing Center e o National
Human Genome Research Institute nos Estados Unidos. A galinha foi o primeiro animal
doméstico a ter seu genoma seqüenciado quase que na sua totalidade. A seqüência derivou
de uma única fêmea da raça Red Jungle Fowl, que é a ancestral selvagem da galinha
doméstica. Correções nesta versão serão incorporadas na seqüência do genoma na medida
em que mais informações forem geradas. Esta seqüência será ainda complementada com o
seqüenciamento do genoma de 3 raças de galinhas domésticas que vem sendo realizado
pelo Beijing Genomics Institute, na China. A comparação das seqüências dessas 3 raças
com a da Red Jungle Fowl e entre elas tem gerado uma coleção muito grande de
polimorfismos genéticos, na sua maioria SNPs (polimorfismos de um único nucleotídeo).
Esses dados serão bastante úteis em futuros estudos de QTL e possivelmente na
compreensão da base genética da domesticação e seleção da galinha moderna (Poultry
Genome Newsletter; no. 2, Abril de 2004). Esses esforços irão prover o geneticista de uma
lista quase completa de todas as seqüências codificadoras, suas localizações
cromossômicas, inúmeros marcadores genéticos e a possibilidade de gerar arranjos de
genes para análises de expressão altamente informativas (Andersson e Georges, 2004).
Estudos de mapeamento comparativo com outras espécies irão auxiliar a procura por genes
importantes e potencialmente úteis em aves.
Estratégias para desvendar o genoma
O mapeamento de QTL e estudos de expressão gênica são procedimentos utilizados para
decifrar parte do controle genético de características de interesse econômico. A
identificação de marcadores associados a QTLs pode ser feita através da varredura de todo
o genoma, utilizando-se marcadores microssatélites (Andersson et al.,1994) ou através de
estudos de genes candidatos (Short et al., 1997). Estudos de expressão gênica irão
complementar esses achados, indicando genes que apresentam diferentes níveis de
expressão e que possam conter a mutação causal que gera essa expressão diferenciada.
Varredura genômica
Esta estratégia utiliza principalmente marcadores microssatélites espalhados pelo genoma
para identificar regiões que afetam características quantitativas. Quanto maior o número de
marcadores utilizados na análise de ligação, maior será a resolução do mapeamento de
QTL. A vantagem desse procedimento é que não exige conhecimento prévio dos genes
envolvidos na expressão do fenótipo de interesse.
Vários estudos de mapeamento de QTL em aves vêm sendo realizados nos últimos anos. Alguns deles já
indicam regiões e marcadores comuns associados a QTLs. Isto é um ponto importante, pois para confirmar a
existência de um QTL ele deve ser identificado em populações independentes (Spelman e Bovenhuis, 1998).
Estas regiões quando confirmadas podem ser utilizadas em estudos visando encontrar qual gene está
influenciando determinada característica. Três marcadores foram associados a QTL para peso corporal em
mais de uma população. Van Kaam et al. (1999) encontraram ligação sugestiva entre o marcador LEI 71 e
peso corporal aos 48 dias de idade no cromossomo 1. Este mesmo marcador foi associado a peso corporal a
13 e 16 semanas por Tatsuda e Fujinaka (2001) e a peso corporal aos 35, 41 e 42 dias por Nones et al. (2003).
O marcador LEI 174 também foi associado a peso corporal por Tatsuda e Fujinaka (2001) e Nones et al.
(2003) nas idades citadas anteriormente. Estes dois marcadores estão muito próximos ao gene IGF-I (Insulinlike Growth Factor I) já mapeado em galinhas e que está diretamente envolvido na regulação do crescimento.
Ruy et al. (2003) e Kerje et al. (2003), estudando o cromossomo 3 em diferentes populações, associaram o
marcador LEI 161 com peso corporal a 42 e 46 dias de idade, respectivamente. Van Kaam, et al. (1998),
Sewalem et al. (2002), Tuiskula-Haavisto et al. (2002) e Baron et al. (2003) identificaram uma região do
cromossomo 4 ligada a peso corporal das aves. Van Kaam et al. (1999) e Tuiskula-Haavisto et al. (2002)
identificaram outra região neste cromossomo associada ao consumo de ração.
McElroy et al. (2002), Ikeobi et al. (2002) e Jennen et al. (2004) encontraram QTLs para
peso e porcentagem da gordura abdominal nos cromossomos 1, 4, 5, 13 e 15, utilizando
marcadores diferentes, indicando que nestas regiões existem genes que influenciam a
deposição de gordura em aves. A região do cromossomo 1 de galinhas em que foram
mapeados estes QTLs para deposição de gordura mostra alta sintenia com partes dos
cromossomos 12 e 22 de humanos (Schmid et al. 2000). Jennen et al. (2004) sugerem
como potenciais genes candidatos por posição no cromossomo 1 os genes: PPARA
(Peroxisome Proliferative Actived Receptor-α), IGF-I, HMGIC (High Mobility Group I-C),
LDHB (Lactate Desidrogenase B) e GAPD (Gliceraldeído-3-fosfato Dehydrogenase).
Estudos em humanos e camundongos indicaram o importante papel da proteína PPARA na
homeostase de lipídeos e proteção contra obesidade. Em raças chinesas um SNP foi
detectado no gene PPARA, onde aves BB apresentaram maior peso de gordura abdominal
do que aves com genótipos AA e AB (Meng et al. 2002). As proteínas IGF-I e HMGIC,
além de estarem envolvidas diretamente na regulação do crescimento, têm papel importante
na obesidade e deposição de gordura em humanos e camundongos. Segundo Jennen et al.
(2004), as proteínas LDHB e GAPD catalisam reações na glicólise e gluconeogênese, vias
intermediárias que são importantes no metabolismo da gordura, entretanto, ainda não há na
literatura a associação desses genes com a deposição de gordura.
Zhu et al. (2003) encontraram uma região no cromossomo 1 associada à produção de
oocitos, relacionada à resistência a coccidiose. Esta foi previamente identificada por
Yonash et al. (1999), associada a viremia em aves infectadas com o vírus da doença de
Marek a um nível sugestivo com o mesmo marcador (LEI 101). Esses resultados sugerem
que nesta região existem genes que regulam a resistência a algumas doenças em aves. No
cromossomo 5, uma região ligada ao marcador ADL 298 foi associada a resposta imune a
Salmonella enteritidis (Kaiser et al., 2002), sendo este marcador anteriormente associado
com resposta imune e sobrevivência a E. coli (Yonash et al., 2001). Este mesmo marcador
está próximo ao locus do gene SAL1, associado a resistência a Salmonella typhimurium por
Mariani et al. (2001), sugerindo mais uma região contendo genes responsáveis por
resistência à doenças. Siwek et al. (2003) mapearam QTL para resposta imune nos
cromossomos 3, 15, 16 e 27. O QTL detectado no cromossomo 16 sugere associação com o
complexo MHC (principal complexo de histocompatibilidade), também localizado neste
cromossomo e que já é um gene candidato para resposta imune. Nos cromossomos 15 e 27
os QTLs mapeados foram associados aos genes da Igh e Igl (Immunoglobulin heavy and
light genes) e TCR (T Cell Receptor Gene).
Outros QTLs foram descritos na literatura sugerindo várias outras regiões do genoma
contendo genes com efeito sobre características de desempenho e resistência à doenças.
Tuiskula-Haavisto et al. (2002) encontraram QTL nos cromossomos 2, 4, 8 e Z
relacionados com qualidade do albúmen, idade ao primeiro ovo, peso do ovo e número de
ovos. Rabie et al. (2002) encontraram QTL nos cromossomos 2, 4 e 6 para susceptibilidade
a ascite e Yonash et al. (2001), no cromossomo 2, para resposta imune ao vírus de
Newcastle. Buitenhuis et al. (2003a, b) mapearam QTL para resposta ao estresse e
comportamento das poedeiras de bicar suas companheiras ou de receberem bicadas. Este
comportamento é difícil de ser selecionado pelo melhoramento tradicional e vem recebendo
atenção da Comunidade da União Européia de bem-estar animal.
Apesar dos QTLs já mapeados em galinhas, ainda não há genes ou marcadores que estejam
sendo utilizados em grande escala em programas de melhoramento. Segundo Burt (2002),
vários QTLs estão sob investigação por empresas de genética avícola. De Koning et al.
(2003) apresentaram o primeiro estudo realizado em uma população comercial de frangos
de corte sem alterar o esquema de seleção da população. Os autores concentraram esforços
em uma região do cromossomo 4 que já havia sido associada a QTL para peso corporal e
consumo de ração em mais de uma população experimental e confirmaram QTLs para peso
corporal, consumo de ração e peso do músculo da coxa.
Estudos de genes candidatos
Genes candidatos são genes envolvidos no desenvolvimento ou fisiologia de determinada característica.
Depois de identificados na espécie de interesse, são seqüenciados para detectar polimorfismos que possam ser
associados com a característica em questão. Se a mutação identificada no gene causa a variação fenotípica na
característica de interesse, é possível a seleção direta para esta, não havendo a necessidade de dados da
família. Este procedimento é limitado ao conjunto de genes conhecidos. Em aves, menos de 800 genes foram
identificados até hoje. Com o seqüenciamento do genoma da galinha a tendência é o aumento do número de
genes identificados, com suas funções e localizações conhecidas, permitindo maior sucesso desse
procedimento na busca pela causa da variação fenotípica.
Características de produção: mutações nos genes do hormônio do crescimento (GH) e seu
receptor (GHR) foram associados com mudanças no peso corporal, gordura abdominal
(Feng et al., 1997) e taxa de postura (Kuhnlein et al., 1997, 1998). Nagaraja et al. (2000)
identificaram um marcador próximo ao gene IGF-I associado a diferenças no peso do ovo e
espessura da casca. Um polimorfismo no gene MC3R (Melanocortin-3 Receptor) foi
investigado em populações de aves e foi significativo para o peso corporal de machos e
fêmeas e para gordura abdominal em machos (Jiang et al. 2002). Um polimorfismo do gene
UCP (Uncoupling Protein) em aves também foi associado com deposição de gordura
abdominal em um estudo conduzido com diferentes linhagens. Animais BB apresentaram
significativamente menor percentagem e menor peso da gordura abdominal quando
comparados a animais do genótipo AB e AA (Zhao et al. 2002). Em outra população, um
SNP do gene IGF-II (Insulin-Like Growth Factor II) foi detectado em aves com efeito
significativo associado ao crescimento e características de carcaça (Yan et al. 2002).
Sourdioux et al. (1999) verificaram associação de polimorfismos de genes envolvidos no
metabolismo de lipídios com variabilidade na deposição de gordura em perus. Li et al.
(2002) encontraram associação significativa entre polimorfismos nos genes da família
TGF-beta (Transforming Growth Factor-beta) com várias características de crescimento e
desenvolvimento em galinhas. O gene MSTN (myostatin) está envolvido na regulação do
crescimento muscular e vários polimorfismos foram identificados, com freqüências
diferentes em distintas raças de galinhas (Gu et al. 2002). O gene PEPCK-C
(Carboxikinase Fosfoenol Pivurato Citosólico) apresenta polimorfismos que afetam o
consumo alimentar residual, que é uma medida de eficiência da utilização do alimento para
manter o peso corporal e a produção de ovos (Parsanejad et al., 2003). O efeito deste gene
sobre o consumo alimentar residual pode estar relacionado com o nível de digestão do
alimento, absorção de nutrientes, ou ainda com diferenças na partição da energia do
alimento para a manutenção corporal e produção de ovos.
Resistência a doenças: o MHC das aves tem sido uma região do genoma investigada e
altamente polimórfica (Nishibori et al. 2000; Iglesias et al 2003). Em uma população
específica para estudos de resistência à Salmonella enteritidis (SE), diferentes genes
candidatos foram investigados. Alelos dos genes do MHC da classe I, NRAMP1 (Natural
Resistance-Associated Macrophage Protein 1), PSAP (prosaposin) e IAP1 (membro da
família de proteínas inibidoras de apoptose) foram associados a colonização de salmonelas
no ceco e baço (Lamont et al. 2002). Polimorfismos nos genes TLR4, CD28 (T-Cell
Specific Surface Protein) e MD-2 também foram identificados nessa população e
apresentaram efeito significativo na resposta a Salmonella enteritidis (Malek et al., 2004).
Mutações do gene NRAMP1 foram anteriormente associadas com susceptibilidade a
salmonelas (Hu et al, 1997). Outro estudo também confirmou o envolvimento do NRAMP1
na resistência à SE (Girard-Santosuosso et al. 2002). O MHC de classe I foi estudado como
gene candidato para a resistência a infecção por SE em uma linhagem de frangos não
endogâmica e em quatro linhagens endogâmicas. Foi observado que um polimorfismo do
MHC de classe I domínio alfa(2), definido como uma substituição de uma lisina por uma
metionina na posição 148, estava associado a carga bacteriana encontrada no baço após o
desafio dos animais com SE, sugerindo que certos haplótipos do MHC podem contribuir
com o controle da resposta a SE, podendo um determinado polimorfismo ser utilizado
como marcador genético para esta característica (Liu et al. 2002).
Além do MHC, outras regiões são importantes na resistência à doenças. O gene TLR4,
localizado no microcromossomo E41W47, está associado à resistência a infecção por
Salmonella enterica sorotipo Thyphimurium (Leveque et al. 2003). O gene PEPCK-M
(Carboxikinase Fosfoenol Pivurato Mitocondrial) apresenta polimorfismos que estão
associados a linhagens resistentes e susceptíveis a manifestação da doença de Marek (Li et
al. 1998). Outros 6 genes relacionados com a imunidade foram selecionados para
determinar a associação de seus polimorfismos com a produção de anticorpos (Zhou e
Lamont, 2003), sendo que 5 deles apresentaram associação significativa com características
de resposta imune. Esses SNPs poderão servir como marcadores genéticos para melhorar a
capacidade imune humoral das aves.
Estudos de expressão gênica
Os avanços na genética molecular, incluindo clonagem e seqüenciamento de DNA e
transgênese têm aberto novas perspectivas para elucidar a relação entre os genes e seus
fenótipos correspondentes. Essas tecnologias podem ser utilizadas para o estudo dos
mecanismos moleculares envolvidos em processos biológicos importantes como a
identificação e caracterização de genes ligados à formação da musculatura esquelética e
deposição de massa muscular; identificação de genes candidatos para suscetibilidade e
resistência à doenças, entre outros. Dentro deste contexto podemos citar as técnicas de
hibridização in situ, RT-PCR em tempo real, northern blot e também aquelas utilizadas
para a análise da expressão de muitos genes simultaneamente como macroarranjos e análise
serial de expressão gênica (SAGE).
Hibrização in situ: a detecção in situ de seqüências de ácidos nucléicos em tecidos
(exemplo: cromossomos, mRNA) permite a visualização direta da localização espacial de
seqüências específicas, o que é crucial para a elucidação da organização e função dos genes
(Wilkinson, 1999). Esta técnica é baseada na detecção de pequenos segmentos de DNA ou
RNA a partir de "sondas" específicas que são seqüências de nucleotídeos complementares
desenvolvidas a partir de segmentos conhecidos do DNA ou RNA que se deseja identificar.
Para visualizar a reação entre as moléculas de DNA ou RNA em estudo e as sondas, estas
são previamente marcadas com substâncias como biotina ou digoxigenina, podendo
utilizar-se também de material radioativo se necessário. Os métodos de hibridização in situ
têm sido bastante utilizados em inúmeras áreas, incluindo detecção de infecções virais e
análise da expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário como MyoD,
envolvido na formação da musculatura esquelética (Alves et al., 2003) e fatores de
crescimento como FGF - Fibroblast Growth Factor (Trueb et al, 2003).
PCR Quantitativo em tempo real: o método de PCR quantitativo em tempo real é muito
sensível e pode ser usado quando é necessário quantificar a expressão de RNAs
mensageiros em baixos níveis. Esse procedimento permite a detecção direta dos produtos
da PCR durante a fase exponencial da reação, combinando amplificação e detecção em um
só passo. O princípio da técnica de PCR em tempo real leva em consideração duas
descobertas importantes: a primeira é a atividade exonuclease 5’´3’da enzima Taq DNA
polimerase e a segunda é a construção de sondas de oligonucletídeos marcadas duplamente.
Essas sondas são baseadas no princípio FRET (do inglês, Fluorescence Resonance Energy
Transfer) e emitem sinal de fluorescência somente quando clivadas. Com o objetivo de
detectar o sinal de fluorescência durante as reações foram desenvolvidas várias químicas.
Em PCR em tempo real utilizando sondas TaqMan, a sonda, específica para o gene de
interesse, é marcada duplamente com um corante repórter em uma extremidade e um
corante “silenciador” na outra. Na forma livre, a transferência de energia fluorescente
ocorre de forma que a emissão pelo repórter é absorvida pelo silenciador. Quando ocorre a
degradação da sonda pela atividade nuclease da enzima Taq DNA polimerase, durante a
PCR, os corantes repórter e silenciador são separados e a emissão de fluorescência do
repórter não será mais absorvida pelo silenciador resultando em um aumento de emissão de
fluorescência pelo repórter que será detectada e quantificada.
Recentemente, outros sistemas sofisticados têm sido desenvolvidos como molecular beacons, scorpions e
sondas para hibridização. Esses sistemas são baseados no princípio FRET, porém sem a necessidade de
hidrólise por atividade nuclease. Outra forma de detecção é a utilização de corantes como SYBR Green que se
liga ao DNA dupla fita emitindo fluorescência. O uso desse método de detecção tem sido bastante empregado
em ensaios de PCR quantitativo em tempo real, com a vantagem de ser mais barato em relação a construção
de sondas marcadas. Um aspecto importante no uso de SYBR Green é que os primers específicos utilizados na
reação de PCR devem ser desenhados cuidadosamente para evitar a amplificação de produtos inespecíficos e
formação de dímeros, uma vez que esse corante se liga a qualquer DNA dupla fita. Usando qualquer uma das
químicas desenvolvidas, o aumento na emissão de fluorescência pode ser lido por um detector em tempo real,
durante a reação de PCR e é uma conseqüência direta da amplificação da seqüência de DNA de interesse
(Giulietti et al, 2001). Utilizando essa técnica, Guernec et al. (2003, 2004) estudaram o perfil de expressão de
miostatina (importante inibidor da miogênese) e IGF I em aves selecionadas para alto rendimento de carne de
peito.
Northern blot: essa técnica permite a detecção de seqüências de RNA (RNA total ou
mensageiro) específicas. O RNA é submetido à eletroforese em gel de agarose seguido por
transferência por capilaridade para uma membrana e posterior hibridização com sondas
específicas. Pode ser utilizada para estudar o padrão temporal de expressão de genes
durante o desenvolvimento.
Macroarranjos de DNA e análise serial de expressão gênica (SAGE): essas técnicas
permitem a comparação simultânea da expressão de um grande número de genes. A
identificação do conjunto de genes expressos por uma célula, tecido ou organismo numa
determinada condição em relação ao conjunto de genes expressos em uma outra condição
com a qual se quer comparar pode permitir a compreensão dos fatores responsáveis pelo
genótipo diferencial. A técnica de macroarranjos de DNA emprega arranjos (arrays) que
contém um grande número de genes roboticamente colocados em membranas. Essa técnica
é bastante utilizada para a escolha de genes diferencialmente expressos para serem
utilizados em análises de PCR em tempo real (Shena et al, 1995). Com a utilização desta
metodologia, Cogburn et al. (2003) identificaram diversos genes diferencialmente
expressos entre linhagens comerciais e linhagens com seleção divergente. A técnica de
SAGE baseia-se no princípio de que seqüências curtas (9 pares de bases) são suficientes
para identificar todos os transcritos presentes em um determinado tecido. O nível de
expressão do transcrito pode ser quantificado pelo número de vezes que ele se repete na
biblioteca. Essa técnica foi descrita em 1995 por Velculescu e colaboradores e tem sido
bastante utilizada para comparar o perfil de expressão de vários genes simultaneamente.
Dentro desse contexto, Long et al. (2003) analisaram o perfil de genes diferencialmente
expressos em sêmen de perus estocado na forma líquida em relação ao recuperado de
fêmeas após a inseminação. Uma vez que o sêmen estocado nos ductos das fêmeas
permanece viável por até 45 dias após a inseminação, a informação obtida nesta análise
pode ser utilizada para desenvolver métodos para estocagem do sêmen na forma líquida.
Os resultados obtidos por meio desses procedimentos podem ser utilizados para intensificar
a resposta em programas de melhoramento genético, pois geram informações sobre dois
tipos de marcadores: mutações causais (marcadores diretos) e marcadores ligados a QTLs
(marcadores indiretos). Mutações causais, que alteram a expressão de características de
produção, são mais difíceis de serem encontradas e comprovadas. Por outro lado,
polimorfismos não funcionais são abundantes no genoma e suas ligações com QTLs podem
ser estabelecidas através de associações entre o genótipo do marcador e a característica
fenotípica e posteriormente utilizadas na seleção assistida (Dekkers e Hospital, 2002).
Implicações da genômica no melhoramento de aves
Todas as informações geradas a partir de estudos genômicos serão essenciais para
incorporação em programas que visem melhorar a produção e qualidade do produto final.
As informações provenientes da genética molecular podem ser usadas para implementar
estratégias de melhoramento através da seleção assistida por marcadores (MAS), que por
sua vez pode ser utilizada em conjunto com a seleção fenotípica, na introgressão de
determinada característica de uma população para outra, mantendo as características
desejáveis da população receptora e também na predição do desempenho e heterose da
progênie resultante de cruzamentos (Dekkers e Hospital, 2002).
Existem 3 estratégias de seleção utilizando marcadores: 1) seleção somente para o
marcador ou escore molecular, 2) seleção no escore molecular seguida de seleção
fenotípica e 3) seleção combinada em um índice baseado no fenótipo e no escore
molecular. Se dados moleculares e fenotípicos são disponíveis, a seleção combinada é a
estratégia mais poderosa (Dekkers e Hospital, 2002). A seleção combinada visa dar pesos
ótimos às informações moleculares e fenotípicas, de acordo com o tamanho do efeito
explicado pelo QTL, com o objetivo de aumentar o ganho genético em longo prazo.
A introgressão é uma estratégia de melhoramento genético utilizada quando se quer
introduzir um gene ou um QTL específico de uma população com baixa produção
(doadora) para outra de alta produtividade (receptora), que não apresenta aquele gene em
particular. Os genes indesejáveis do genoma do doador devem ser excluídos o mais rápido
possível do genoma do receptor. Esta estratégia envolve apenas retrocruzamento e seleção,
mas marcadores moleculares podem melhorar a eficiência da introgressão pela
identificação de portadores do gene de interesse e acelerando o processo de reconstituição
da composição genética do receptor (Dekkers e Hospital, 2002).
O cruzamento entre linhagens geneticamente distintas é amplamente utilizado em
programas de melhoramento de aves com o objetivo de promover a heterose para
características de baixa herdabilidade, como produção de ovos e fertilidade. A diversidade
genética entre populações pode ser acessada pelo uso de marcadores, que podem ser
utilizados também para estimar as distâncias genéticas entre linhagens para predizer a
heterose (Ponsuksili et al., 1999) e orientar cruzamentos e acasalamentos.
No geral, a informação molecular na seleção deverá ser combinada com a seleção fenotípica para a
exploração completa da genética que controla a característica de interesse e o uso da MAS será determinado
pelo benefício econômico em relação a seleção convencional. O uso de marcadores na seleção envolve custos
inerentes a identificação de QTL, extração de DNA, genotipagem e análise. Segundo Dekkers e Hospital
(2002), o mérito econômico da MAS não é questionável em situações em que o custo molecular é
compensado pelas economias na avaliação fenotípica, como na seleção para resistência à doenças e qualidade
da carne, e também no caso da seleção precoce, que compensa o custo extra da MAS, especialmente em
mercados competitivos.
Para a seleção de algumas características como produção de ovos, o custo limita o número
de animais a serem testados. Com a identificação de marcadores ligados a QTLs
importantes, a seleção poderá ser realizada em idade precoce a partir de uma população
maior, mantendo um número menor de indivíduos para avaliações posteriores. Outro
exemplo seria a utilização de marcadores genéticos para a pré-seleção de galos em
programas de melhoramento de aves de postura, sendo a seleção final realizada após o
término do registro total das irmãs (normalmente apenas um ou dois machos são
selecionados ao acaso de cada família de irmãos completos devido ao custo). A seleção
para melhorar o bem-estar animal é difícil e requer medidas diretas ou indiretas, usando
seleção em grupo. Marcadores ligados a QTLs que melhorem o bem-estar e não
comprometam produtividade permitiriam a seleção genotípica de fenótipos difíceis de
serem medidos. Características limitadas pelo sexo (produção de ovos) ou que não podem
ser medidas diretamente nos indivíduos (resistência à doenças), serão as mais beneficiadas
pelo uso da genética molecular, pois o melhoramento tradicional requer o uso de teste de
irmãos ou de progênie, o que reflete em custo elevado ou aumento do intervalo entre
gerações (Muir, 2002).
Empresas de genética avícola estão concentrando esforços para o melhor entendimento das
barreiras biológicas que estão ocorrendo com o aumento do desempenho das aves. O
desenvolvimento de marcadores genéticos nesse caso será de grande valor, pois permitirá
uma seleção simples e eficiente para novas características (relacionadas com mecanismo
biológico básico), que diferentes das tradicionalmente utilizadas (de produção), serão mais
difíceis de serem medidas (Albers e Groot, 1998).
Considerações finais
Embora vários QTLs tenham sido identificados em aves e em certos casos confirmados em
outras populações, estes apresentam ainda um intervalo de confiança muito grande, com a
presença de muitos genes, dificultando sua utilização nos programas de melhoramento.
Estudos de expressão e a conclusão do seqüenciamento completo do genoma da galinha
serão cruciais para a integração dos diversos procedimentos utilizados na tentativa de
decifrar a base genética da variação fenotípica das características de produção, o que
permitirá detectar a mutação que causa o efeito do QTL.
Os avanços nas pesquisas em genômica estrutural e funcional, no mapeamento comparativo dos genes de
diferentes espécies e na genética quantitativa irão acelerar o processo de descobrimento da função dos genes.
O conjunto dessas informações auxiliará na descoberta dos genes envolvidos no controle de características
poligênicas, podendo mudar o paradigma da seleção genética. Isso aumentará as chances de otimizar o ganho
genético com o uso da seleção assistida por marcadores em programas de melhoramento, através da avaliação
de características fenotípicas não tradicionalmente utilizadas na seleção genética.
A seleção assistida por marcadores nas empresas de genética avícola encontra-se em fase experimental. Esta
poderá ser incorporada a qualquer momento nos respectivos programas dessas empresas. Há, entretanto, a
necessidade de estudos mais detalhados sobre estratégias de seleção que otimizem o uso da MAS, bem como
da redução do custo molecular envolvido, antes que esses conhecimentos passem a ser integrados nos
programas de melhoramento de aves.
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