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ANÁLISE DAS HEMOGLOBINAS INSTÁVEIS EM - propp

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ANÁLISE DAS HEMOGLOBINAS INSTÁVEIS EM - propp
ANÁLISE DAS HEMOGLOBINAS INSTÁVEIS EM UMA AMOSTRA DA
POPULAÇÃO DA CIDADE DE TRÊS LAGOAS (MS), BRASIL.
Mário Augusto da Silva Freitas¹, Jéssika Viviani Okumura² & Danilo Grünig Humberto da Silva3
¹ Orientador e professor da UFMS, Departamento de Enfermagem aplicada à Biotecnologia da SaúdeUFMS/CPTL, e-mail: [email protected]
² Acadêmica de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas - UFMS/CPTL, e-mail:
[email protected]
³ Mestrando do Programa de Pós Graduação em Genética do Laboratório de Hemoglobinas e Genética das
Doenças Hematológicas - UNESP/IBILCE, e-mail: [email protected]
RESUMO
As hemoglobinas instáveis constituem um grupo de alterações genéticas em que mutações no
genes das cadeias globínicas afetam a estrutura da molécula, tornado-a instável. O presente
estudo objetivou realizar uma triagem populacional de portadores de hemoglobinas instáveis
através de metodologias específicas e realizar o estudo familial dos portadores oferecendolhes orientação genética. Foram analisadas 123 amostras de sangue periférico colhido em
frascos estéreis contendo EDTA a 5%, após consentimento informado, de uma amostra
populacional do Município de Três Lagoas (MS) – estudantes, gestantes e pré-maritais. A
metodologia baseou-se em testes seletivos: análise da morfologia eritrocitária em esfregaço
sangüíneo a fresco e, quando necessário, corados pela a técnica de May-Grünwald, resistência
globular osmótica em solução de cloreto de sódio 0,36%, teste de solubilidade em Tampão de
Amônio/Fosfato pH 7,1 e eletroforese em gel de poliacrilamida com tampão Tris-Glicina em
pH alcalino (8,0). A avaliação da estabilidade da molécula de hemoglobina foi realizada
através de testes específicos: pesquisa dos corpúsculos de Heinz, desnaturação química ao
isopropanol-tris-HCL pH 7,4 e desnaturação pelo calor (aquecimento da solução do
hemolisado entre 50-60° C). A prevalência encontrada foi de dois (1,62%) indivíduos
positivos para todos os testes específicos de estabilidade da molécula de hemoglobina, oito
(6,48%) apresentaram alguma alteração nos testes para a Hb instável e 14 (11,4%) tiveram
outros tipos de hemoglobinopatias hereditárias, todos os casos heterozigotos, como, por
exemplo, traço alfa-talassêmico, traço falciforme, traço beta-talassêmico e outros. O
resultado, para hemoglobinas instáveis, foi baixo, porém concordante com a literatura e de
grande importância, pois diagnosticou de forma adequada, um indivíduo que fora por anos
tratado como portador de anemia ferropriva recorrente, e demonstrou sua validade e
exequibilidade em programas populacionais, principalmente em regiões carentes.
Palavras-chave: Hemoglobinopatias, Hemoglobinas instáveis.
INTRODUÇÃO
Mutações que afetam os genes de globinas levam às hemoglobinopatias, que,
genericamente, podem ser classificadas em dois grandes grupos: as alterações de estrutura,
com a formação de hemoglobinas (Hb) variantes, e as alterações de síntese (talassemias), com
a supressão parcial ou total de um ou mais tipos de cadeias globínicas; menos freqüentemente,
esses dois fenótipos podem ocorrer em associação (ZAGO et al, 2004; COSTA et al, 2007;
WENNING et al, 2007, apud in SONATI et al, 2008). A Organização Mundial de Saúde
(OMS) estima que 5% da população mundial seja portadora de algum tipo de anemia
hereditária (BONINI-DOMINGOS et al, 2004).
Dentre as hemoglobinopatias conhecidas, são descritas as hemoglobinas instáveis, que
constituem um grupo de alterações genéticas em que mutações de aminoácidos nas cadeias
globínicas alfa ou beta afetam a estrutura da molécula, tornado-a instável. As técnicas
específicas para o diagnóstico laboratorial são: teste de desnaturação pelo calor (aquecimento
da solução do hemolisado entre 50-60° C), teste de desnaturação química ao isopropanol-trisHCL pH 7,4 (incubação com isopropanol-HCL a 37° C), ou agitação vigorosa do tubo
contendo o hemolisado. Dessa forma, as hemoglobinas que se precipitam mais rapidamente
do que as normais são denominadas instáveis (NAOUM, 1997).
As Hbs instáveis formam um grupo de aproximadamente 150 tipos de Hbs anormais
que causam anemias hemolíticas, crônicas ou agudas de intensidade variável (grave,
moderada ou discreta), icterícia e presença de urina escura em seus portadores. São
identificadas pela tendência de se precipitarem quando submetidas ao calor, agitação intensa
e/ou métodos físico-quimicos específicos (NAOUM et al, 2007).
Fisiologicamente, a instabilização da Hb decorre de uma ligação anormal entre as
cadeias alfa e beta, provocando a desestabilização das globinas; ou na região interna da
molécula que constitui o nicho do grupo heme, provocando o seu afrouxamento. As globinas
desestabilizadas se precipitam e formam os corpos de Heinz (Figura 1) (AC&T).
.
Figura 1: Corpos de Heinz precipitados em sangue de portador de Hb Instável (AC&T)
Estes, por sua vez, fixam-se na membrana dos eritrócitos por duplas ligações de
enxofre, alterando-lhe a permeabilidade e a osmose, provocando, consequentemente, a sua
destruição precoce e a anemia (AC&T)
Devido à grande diversidade dos pontos de mutações por substituições e deleções de
aminoácidos, as formas de instabilidade apresentam grande variabilidade funcional. Algumas
hemoglobinas são discretamente instáveis e não estão associadas a sintomas clínicos,
enquanto outras se precipitam com grande intensidade, causando anemias hemolíticas
(BONINI-DOMINGOS, 1993).
Essas anemias podem ser graves, com acentuada diminuição dos níveis de
hemoglobina e reticulocitose, ou então, podem se apresentar com discreto quadro hemolítico
acompanhado por modesta reticulocitose. Uma das principais características das
hemoglobinas instáveis que causam anemia hemolítica é a presença de corpos de Heinz.
A grande maioria das hemoglobinas instáveis descritas origina-se de trocas de
aminoácidos neutros, por exemplo, prolina por treonina, tirosina por leucina, etc. Essas
substituições de aminoácidos não causam alterações de cargas elétricas e, portanto, não
alteram o ponto isoelétrico da hemoglobina mutante. Por esta razão, dificilmente as
hemoglobinas instáveis apresentam posições eletroforéticas ou cromatográficas diferentes da
HbA. O eritrograma mostra anemia variável entre discreta e acentuada, VCM normal ou
diminuído, HCM sempre diminuído, morfologia eritrocitária com presença de células
mordidas e reticulocitose moderada a acentuada (NAOUM, 1997; NAOUM et al, 2007).
A elevada prevalência de hemoglobinopatias encontradas na população brasileira
acompanhada de morbimortalidade expressiva, e o fato de as anemias hereditárias serem,
geralmente, mal diagnosticadas e tratadas de forma inadequada justificam a necessidade de
investigação, por diferentes metodologias laboratoriais e estudo familiar para auxiliar no
diagnóstico precoce, possibilitando minimizar os sintomas decorrentes da hemoglobina
anormal e a realização do aconselhamento genético e educacional de portadores dessas
alterações hereditárias (SCHIAVETO et al, 2002).
Mediante o apresentado e tendo em vista que, não existem em nosso país programas
populacionais de triagem para hemoglobinopatias oferecidos pelos serviços de saúde pública,
a presente pesquisa teve como objetivos: realizar uma triagem populacional de portadores de
hemoglobinas instáveis através de metodologias específicas e realizar o estudo familial dos
portadores oferecendo-lhes aconselhamento genético educacional.
METERIAL E MÉTODOS
1- Casuística
A amostra populacional estudada do Município de Três Lagoas (MS) consistiu de
indivíduos do sexo masculino ou feminino de qualquer origem étnica ou social de diferentes
sub-populações: gestantes da Clínica da Mulher e do Projeto Municipal Colo de Mãe, prémaritais provenientes de cursos para noivos das Igrejas Nossa Senhora Aparecida e Catedral
Sagrado Coração de Jesus e estudantes da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul.
Todas as amostras de sangue foram coletadas em frascos estéreis contendo EDTA a
5%, após assinatura do participante ou de seu responsável (no caso de menores de idade), de
um Termo Consentimento Livre e Esclarecido, de acordo com a orientação do Comitê de
Ética da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Os únicos critérios de exclusão
consistiram na recusa em participar da pesquisa e o conhecimento prévio de sua condição
genética.
2- Métodos
Após a coleta, as amostras de sangue foram levadas ao Hemocentro da cidade de Três
Lagoas para a realização do hemograma completo; e, em seguida, encaminhadas ao
laboratório de Genética Médica, onde foram realizadas as técnicas hematológicas adequadas
ao diagnóstico laboratorial de hemoglobinopatias hereditárias:
•
análise da morfologia eritrocitária em esfregaço sangüíneo a fresco e posteriormente
corados pela a técnica de May-Grünwald;
•
eletroforese em pH alcalino em gel de poliacrilamida em tampão Tris-Glicina, pH 8,0
•
pesquisa dos corpúsculos de Heinz através da coloração com Azul Cresil Brilhante a
1% utilizando 50µL de corante e 50µL de sangue, aquecidos por trinta minutos em
banho-maria a 37°C, colocar 15µL da solução incubada no centro de uma lâmina e
cobrir com lamínula pressionando levemente em um papel para retirar o excesso de
amostra e por fim, examinar ao microscópio com objetiva de imersão;
• teste de precipitação por isopropanol que faz algumas Hb instáveis se precipitarem por
serem sensíveis a produtos químicos. O procedimento consiste em colocar 2mL de
tampão Tris/isopropanol em tubo de ensaio e incubar por 5 minutos a 37ºC, adicionar
ao tampão incubado 200µL de hemolisado, agitar o tubo por inversão, arrolhar
com gase e incubar por 40 minutos a 37ºC observando se houve precipitação a
cada 10 minutos (CARREL & KAY, 1972);
• teste de desnaturação pelo calor que consiste em colocar 1mL de sangue fresco
em um tubo de hemólise, centrifugar a 1.500 rpm por 5 minutos e desprezar o
plasma, centrifugar por duas vezes a 1.500 rpm por 5 minutos lavando os
eritrócitrócitos com NaCl 0,85%, adicionar 5mL de água destilada,
homogeneizar por seis vezes por inversão, adicionar 5mL do tampão fosfato
(pH 7,4), homogeneizar por seis vezes por inversão e centrifugar por 10
minutos a 1.500 rpm. Transferir 2mL do sobrenadante para um tubo de ensaio,
arrolhar com gase e incuba-lo a 50-60ºC em banho-maria por uma hora
observando se houve precipitação a cada 10 minutos (DACIE & LEWIS,
1985).
Ao término das atividades de triagem, todos os portadores de hemoglobinas anômalas
receberam cartões de identificação como portadores da respectiva alteração diagnosticada,
com algumas recomendações e cuidados relativos à sua condição (Figura 2).
Figura 2 – Modelo do cartão de identificação de portador do traço falciforme.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No período de agosto de 2008 a julho de 2009 foram analisadas 123 amostras de
sangue periférico de diferentes grupos populacionais, destas 10 (8,10%) apresentaram alguma
anormalidade para as hemoglobinas instáveis, 4 (3,3%) traço β- talassêmico, 3 (2,5%) traço αtalassêmico, 1 (0,8%) Hb S/β, 1(0,8%) Hb Lepore/β, 1 (0,8%) Hb AJ, 1 (0.8%) traço
falciforme, 1 (0,8%) Hb AC, 1 (0,8%) eliptocitose e 1 (0,8%) anemia ferropriva (Tabela 1).
Tabela 1: Frequência fenotípica da população estudada
Total
140
123
100%
120
Anormalidade para Hbs
instáveis
Traço beta- talassêmico
100
Traço alfa- talassêmico
Hb S/beta
80
Hb Lepore/beta
60
Hb AJ
40
20
Traço Falciforme
10
8,1%
4
3
1
1
1
1
1
1
1
3,3% 2,5%
0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8%
0
Alteração das Hemoglobinas
Hb AC
Eliptocitose
Anemia ferropriva
Dentre as 10 amostras com certo grau de instabilidade, dois (1,62%) apresentaram
positividade para todos os testes específicos, ou seja, pesquisa de corpúsculos de Heinz, testes
de desnaturação por isopropanol e pelo calor; um (0,81%) para corpúsculo de Heinz e
desnaturação por isopropanol; dois (1,62%) apenas por isopropanol e 5 (4.05%) somente para
corpúsculos de Heinz (Gráfico 1).
GRÁFICO 1: Distribuição dos diferentes níveis de instabilidade encontrados.
Todos os testes
1,62%
Corp. de Heinz e desn por
isopropanol
4,05%
0,81%
1,62%
Desn por isopropanol
Corp. de Heinz
Por serem as hemoglobinopatias de maior dificuldade diagnóstica, são fundamentais
para o seu diagnóstico adequado as informações clínicas do paciente, com destaque para
processo hemolítico (NAOUM, 1997). Por isso, após a assinatura do TCLE, foi aplicado um
questionário para obtenção de informações hematológicas e um breve histórico clínico do
indivíduo e de sua família, relatado pelo próprio. E, através dessas informações foi possível o
esclarecimento da condição e orientação de um dos portadores de Hb instável, que reclamara
de anemia recorrente e por anos foi diagnosticada e tratada erroneamente como portadora de
anemia ferropriva.
Os resultados demonstram a importância da continuação e ampliação de tais
programas populacionais, os quais estão restritos a pouquíssimos centros em nosso país.
CONCLUSÕES
O presente estudo permitiu chegar-se às seguintes conclusões: (1) a frequência total de
qualquer grau de instabilidade hemoglobínica na amostra do presente estudo foi de 8,10%,
portanto, bastante significativa em termos de triagem populacional para este tipo de doença;
(2) a importância de um diagnóstico adequado para hemoglobinopatias hereditárias evitando
interpretações e tratamentos clínicos equivocados e (3) a importância de aumentar os centros
especializados bem como a quantidade de pessoal capacitado para diagnóstico e
acompanhamento de portadores de anemias hereditárias na rede de Saúde.
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